Борис Пустынцев родился в 1935 году во Владивостоке. После назначения в 1951 году его отца, Павла Петровича Пустынцева начальником Центрального конструкторского бюро морской техники «Рубин», переехал в Ленинград.

В 1954 году поступил в 1-й Ленинградский педагогический институт иностранных языков. Будучи студентом участвовал в подпольной группе, состоявшей в основном из учащихся института, распространявшей в ноябре 1956 года листовки с протестом против подавления советскими войсками восстания в Венгрии. В 1957 году после ареста вместе с другими участниками группы был приговорен к 10 годам лишения свободы и находился в лагерях для политзаключенных до 1962 года.

После освобождения закончил вечернее отделение Педагогического института им. Герцена по специальности «английский язык». Работал библиографом, переводчиком технической литературы, литературным редактором, автором синхронных текстов в кино, режиссером дубляжа.

В 1991 году Борис Пустынцев становится сопредседателем Санкт-Петербургского отделения правозащитного общества «Мемориал», в должности которого он пребывает до 1996 года.

В 1992 году вместе с группой правозащитников, юристов, журналистов, депутатов Государственной Думы РФ и Городского Совета Санкт-Петербурга создает общественную правозащитную организацию «Гражданский контроль», председателем которой он являлся с основания организации до своей смерти. Целью организации является содействие установлению контроля со стороны гражданского общества над деятельностью правоохранительных государственных органов для предотвращения нарушения ими конституционных прав граждан.

Во второй половине 90-х годов, когда начались преследования экологических активистов, распространявших информацию об экологических опасностях, Борис Пустынцев вместе с правозащитником Юрием Вдовиным, адвокатом Юрием Шмидтом и экологическим журналистом Виктором Терешкиным выступает с инициативой создания организации, которая могла бы защищать не только отдельных активистов, но и права всех граждан на благоприятную окружающую среду и на достоверную информацию об ее состоянии. Так в апреле 1998 года была учрежден Экологический правозащитный центр «Беллона».

С 2004 по 2012 год Борис Пустынцев являлся членом Совета при Президенте РФ по содействию развитию институтов гражданского общества и правам человека.